TCDCA与糖皮质激素受体的相互作用及其对活化蛋白-1的影响

【摘要】牛磺鹅去氧胆酸(TaurochenodeoxycholicAcid,TCDCA)广泛存在于动物胆汁中,是动物胆汁酸的有效成分之一,具有显著的抗炎及免疫调节作用。TCDCA在结构上具有环戊烷多氢菲的基本母核,与甾体激素具有相似的化学结构。为了更加深入揭示TCDCA的抗炎免疫调节作用机制,本研究以佐剂性关节炎(Adjuvantarthritis,AA)模型大鼠成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-likesynoviocytes,FLS)为研究对象,探讨了TCDCA与糖皮质激素受体(Glucocorticoidreceptor,GR)的相互作用及其对转录因子活化蛋白1(Activatorprotein-1,AP-1)和AA大鼠FLS细胞凋亡的影响。具体研究内容如下：(1)TCDCA与GR的相互作用采用Autodock软件将TCDCA与GR进行分子对接研究；采用萤光素酶报告基因法检测GR的激活情况：采用荧光显微镜追踪GR核移位。研究结果显示,TCDCA能够与GR732位上的亮氨酸以氢键发生相互作用,其结合吉布斯自由能变为-4.51kcal/mol,解离常数Kd=498.39μM;与对照组相比,1×10-4MTCDCA能够显著激活GR并发生核移位。(2)TCDCA对AP-1及细胞间粘附分子-1表达与活性的影响采用westernblot法检测了AA大鼠FLS中c-Fos、c-Jun、磷酸化c-Jun(p-c-Jun(Ser63))的表达；采用ELISA法检测了AP-1的DNA结合活性活性。研究结果显示,1×10-6～1×10-4MTCDCA均能够显著降低c-Fos、c-Jun、p-c-Jun(Ser63)蛋白表达量及AP-1DNA结合活性。采用qPCR法检测了AA大鼠FLS中细胞间粘附分子-1(Intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)mRNA的表达量；采用ELISA法检测了AA大鼠FLS中ICAM-1蛋白表达量。研究结果显示,1×10-6～1×10-4mol/LTCDCA均能够显著抑制ICAM-1mRNA和蛋白的表达(P<0.05),且该抑制作用可被GR阻断剂米非司酮(RU486)所拮抗。(3)TCDCA对AA大鼠FLS细胞凋亡的影响采用流式细胞术检测了TCDCA对AA大鼠FLS细胞凋亡率的影响：采用qPCR法检测了TCDCA对AA大鼠FLS细胞凋亡相关基因caspase-3、caspase-8mRNA表达量的影响,并采用ELISA法检测了TCDCA对AA大鼠FLS细胞Caspase-3、Caspase-8活性的影响。结果显示,TCDCA(400μg/mL)与对照组相比,可极显著增加FLS凋亡的百分率(P<0.01);TCDCA(400μg/mL)与对照组相比,可显著提高caspase-8基因表达水平(P<0.05);TCDCA(400μg/mL)与对照组相比,可极显著提高caspase-3基因表达水平(P<0.01)；TCDCAC(50～200μg/mL)与对照组相比,可显著提高Caspase-8活性(P<0.05)；TCDCA(100～200jig/mL)与对照组相比,可显著提高Caspase-3活性(P<0.05),TCDCA(400μg/mL)可极显著提高Caspase-3活性(P<0.01)。本研究的主要结论如下：(1)TCDCA能够与GR结合并激活GR；(2)TCDCA能够显著抑制c-Jun、p-c-Jun、c-Fos蛋白表达并抑制AP-1DNA结合活性；(3)TCDCA能够显著抑制AA大鼠FLS细胞ICAM-1基因与蛋白的表达；(4)TCDCA能够显著增加AA大鼠FLS细胞Caspase-3、Caspase-8的基因表达及其活性,并促进FLS细胞凋亡。(5)TCDCA的抗炎免疫调节作用与其影响糖皮质激素受体介导的基因组学信号通路有关。
【作者】李磊；
【导师】李培锋；
【作者基本信息】内蒙古农业大学，基础兽医学，2014，博士
【关键词】牛磺鹅去氧胆酸；成纤维样滑膜细胞；糖皮质激素受体；活化蛋白-1；细胞间粘附分子-1；细胞凋亡；

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